Выбор биофильтра для большеротого окуня- Характеристики биопленки и показатели роста
Большеротый окунь (Micropterus salmoides), также известный как калифорнийский окунь, принадлежит к Actinopterygii, Perciformes, Centrarchidae, Micropterus. Он родом из Калифорнии, США, и имеет такие преимущества, как быстрый рост, восхитительный вкус, богатая питательная ценность и высокая экономическая ценность. Он стал одним из важных видов пресноводной аквакультуры в Китае. В последние годы на фоне трансформации и модернизации рыболовства, а также энергичного развития цифрового и интеллектуального рыболовства постепенно возникла индустриализированная рециркуляционная аквакультура. Режим аквакультуры большеротого окуня также переходит от традиционного прудового выращивания к зеленому и эффективному режиму рециркуляционной аквакультуры. Рециркуляционная аквакультура имеет такие преимущества, как экономия воды и земли, высокая плотность посадки и удобное управление. С помощью физических, биологических, химических методов и оборудования твердые взвешенные вещества и вредные вещества в водоеме удаляются или преобразуются в безвредные вещества, так что качество воды соответствует нормальным потребностям роста культивируемых видов, тем самым реализуя рециркуляцию воды в условиях аквакультуры с высокой-плотностью. Это принесло хорошие экономические выгоды для многих культивируемых видов.
В настоящее время исследования в области замкнутой аквакультуры большеротого окуня в основном сосредоточены на воспроизводстве, кормовом питании, выборе сортов, точном кормлении, изменении водной среды и качестве питательных веществ. Исследования в области промышленной рециркуляционной аквакультуры большеротого окуня в закрытых помещениях в основном сосредоточены на выращивании молоди крупных-молодых рыб, а выращивание взрослой рыбы полного-цикла не получило широкого распространения. Основная проблема, с которой сталкивается рециркуляционная аквакультура большеротого окуня, — это поддержание хорошей водной среды в условиях высокой-плотности для обеспечения нормального роста выращиваемых видов. Очистка воды является основой рециркуляционной аквакультуры, а эффективные биофильтры для очистки воды являются основой системы очистки воды. Хотя существует множество отчетов об очистке воды с помощью биофильтрующих материалов, отчеты, в частности, о промышленной рециркуляционной аквакультуре большеротого окуня, особенно в отношении скрининга эффективных биофильтрующих сред для очистки воды, структуры микробного сообщества биопленок на различных биофильтрующих средах, эффектов обработки и воздействия на рост культивируемых видов, отсутствуют. Были выбраны три типа биофильтрующего материала, среди которых квадратный губчатый биофильтр и шариковый биофильтр с псевдоожиженным слоем, которые имеют низкую-стоимость, просты в эксплуатации и широко используются при очистке сточных вод аквакультуры; Mutag Biochip 30 (сокращенно Biochip) — это новый тип биофильтрационного материала, появившийся в последние годы, обладающий преимуществами ударопрочности и длительного срока службы, но о его практическом применении не сообщалось. С этой целью была использована технология высокопроизводительного секвенирования 16S рДНК для анализа ситуации с образованием биопленки в трех биофильтрующих средах для очистки воды, одновременно анализируя ситуацию с ростом большеротого окуня, чтобы отобрать практичные биофильтрационные среды для очистки воды и обеспечить эффективные среды для очистки воды для промышленной рециркуляционной аквакультуры большеротого окуня.
1. Материалы и методы.
1.1 Материалы для испытаний
Биофильтрационные материалы, выбранные для этого теста, быликвадратная губка, Биочип, ишар в псевдоожиженном слое, как показано наРисунок 1. Квадратный губчатый материал представляет собой полиуретан, имеющий форму куба со стороной 2,0 см, удельная площадь поверхности (3,2~3,5)×10⁴ м²/м³. Материал Биочипа – полиэтилен, имеющий форму круга диаметром 3,0 см, толщиной около 0,11 см, удельной поверхностью 5,5×10³ м²/м³. Материал шара псевдоожиженного слоя представляет собой полиэтилен, эффективная удельная поверхность 500~800 м²/м³.
1.2 Экспериментальная группировка
Группа обработки квадратной губчатой биофильтрационной среды была обозначена как группа T1, соответствующая биопленка среды была обозначена B1, а соответствующая вода для аквакультуры была обозначена W1; группа обработки биофильтрационной среды Biochip была обозначена как группа T2, соответствующая биопленка среды была помечена B2, а соответствующая вода для аквакультуры была помечена W2; группа обработки биофильтрационной среды с шариками с псевдоожиженным слоем была обозначена как группа T3, соответствующая биопленка среды была обозначена B3, а соответствующая вода для аквакультуры была обозначена W3.
1.3 Система аквакультуры
Эксперимент проводился в системе рециркуляционной аквакультуры на Балидианской комплексной экспериментальной базе Чжэцзянского института пресноводного рыболовства.Всего было 9 культуральных резервуаров объемом 500 л, эффективный объем воды 350 л. Бак биофильтра представлял собой пластиковый аквариум длиной 80 см, шириной 50 см и высотой 50 см, объемом 200 л, эффективным объемом воды 120 л.. Культуральный резервуар и резервуар биофильтра были соединены водяным насосом для образования внутренней циркуляции, скорость потока 3 ~ 4 л/мин, с аэрацией для оксигенации, содержание растворенного в воде кислорода поддерживалось выше 5 мг/л. Биофильтрационные материалы были сгруппированы случайным образом, каждый тип биофильтрующих материалов имел 3 повтора, в каждый бак биофильтра было загружено 2,0 кг биофильтрующего материала, одновременно суспендируя источник углерода с медленным-высвобождением. В период культивирования биопленки ежедневно меняли 10% воды.Исходные показатели качества воды: общий азот (TN) 9,41 мг/л, общий фосфор (TP) 1,02 мг/л, аммиачный азот (TAN) 1,26 мг/л, нитритный азот (NO₂⁻-N) 0,04 мг/л, перманганатный индекс (CODₘₙ) 3,73 мг/л..
1.4 Тестовая рыба и управление культурой
В качестве культивируемого вида использовался большеротый окунь. Перед началом испытаний их акклиматизировали в оборотной воде в течение 7 дней.Испытание проводилось с 11 августа 2022 г. по 22 сентября 2022 г. и продолжалось 42 дня.. Большеротый окунь без поверхностных повреждений, здоровый и живой, был выбран для группировки, в каждый культуральный резервуар помещалось по 60 рыб, которых кормили два раза в день, время кормления составляло 07:00 утра и 16:00 дня, суточное количество корма составляло около 1,0% ~ 1,5% от общей массы тела рыбы. Исходная масса тела подопытных рыб составляла (20,46 ± 0,46) г.
1.5 Сбор образцов
Пробы воды из резервуара биофильтра отбирали каждые 2 дня, фиксируя такие показатели, как температура воды, растворенный кислород, значение pH, а также измеряя аммиачный азот и нитритный азот. Регистрировали количество корма, массу тела рыб в начале и в конце эксперимента, а также выживаемость. После эксперимента 1 л воды из каждого культурального резервуара собирали с помощью стерильных мешков для сбора воды, фильтровали через фильтрующую мембрану с размером пор 0,22 мкм и хранили в морозильной камере при температуре -80 градусов для дальнейшего использования. Образцы биофильтрационной среды массой 0,5 г отбирали в асептических условиях из каждого резервуара биофильтра, хранили в стерилизованной дистиллированной воде, энергично встряхивали для удаления микроорганизмов с поверхности биопленки, затем фильтровали через фильтрующую мембрану с размером пор 0,22 мкм и хранили в морозильной камере при -80 градусах для дальнейшего использования.
1.6 Методы измерения
1.6.1 Измерение качества воды
Температуру воды, растворенный кислород и значение pH определяли с помощьюПортативный анализатор качества воды HACH Hq40d. Концентрацию аммиачного азота измеряли спектрофотометрическим методом с реагентом Несслера. Концентрацию нитритного азота определяли спектрофотометрическим методом нафтилэтилендиамина соляной кислоты.
1.6.2 Измерение эффективности аквакультуры
Формулы расчета скорости привеса, коэффициента конверсии корма и выживаемости рыб следующие.
l Скорость набора веса= (Конечная масса тела рыбы - Начальная масса тела рыбы) / Начальная масса тела × 100 %;
l Коэффициент конверсии корма= Потребление корма/привес веса;
l Выживаемость= (Количество рыб в конце эксперимента / Начальное количество рыб в начале эксперимента) × 100%.
1.6.3 Высокопроизводительное-микробиологическое секвенирование
ДНК бактерий выделяли из воды и биопленки с помощью набора Bacterial DNA Extraction Kit («OMEGA Biotech», США). Для амплификации областей V3 и V4 бактериальной 16S рДНК использовали специфические праймеры 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') и 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'). Для ПЦР использовалась реакционная система TransGen AP221-02: 4 мкл 5×FastPfu Buffer, 2 мкл 2,5 ммоль/л dNTPs, 0,4 мкл FastPfu Polymerase, по 0,8 мкл каждого из 5 мкмоль/л прямого и обратного праймеров, 0,2 мкл BSA, 10 нг ДНК-матрицы, дополненной ddH₂O до 20 мкл. Условия реакции ПЦР: 95 градусов, 3 мин; 95 град 30 с, 53 град 45 с, 72 град 1 мин, 28 циклов; Разгибание на 72 градуса в течение 10 мин. ПЦР-амплификацию проводили на приборе для ПЦР-реакции 9700 (Applied Biosystems® GeneAmp®, США). Продукты ПЦР очищали с помощью Beads и затем подвергали секвенированию. Секвенирование было поручено компании Shanghai Majorbio BioPharm Technology Co., Ltd.
1.6.4 Анализ микробного разнообразия
Необработанные данные, полученные в результате секвенирования, сначала подвергались сплайсингу, после чего осуществлялась фильтрация контроля качества считываний и эффекта сплайсинга, а также коррекция направления последовательности, что приводило к оптимизации данных. После нормализации окончательно полученных чистых данных был проведен кластерный анализ OTU (Оперативные таксономические единицы) и таксономический анализ при сходстве 97%. Гистограммы образцов были построены с использованием Excel, а тепловые карты — с помощью облачной платформы Majorbio.
1.7 Анализ данных
Статистическое программное обеспечение SPSS 16.0 использовалось для анализа значимости различий, а метод дисперсионного анализа Дункана (ANOVA) использовался для множественных сравнений.
2. Результаты и анализ
2.1 Время формирования биопленки различных биофильтрующих материалов
Как показано вРисунок 2,В условиях образования естественной биопленки содержание аммиачного азота в воде биофильтра имело тенденцию к быстрому росту с последующим постепенным снижением.Содержание аммиачного азотав воде резервуара биофильтра, соответствующей квадратной губке, достигал своего пика через 17 дней - 8,13 мг/л, затем постепенно снижался,достигнув самого низкого уровня в 41 день, после чего остается около 0,20 мг/л, что указывает на то, чтовремя образования биопленки квадратной губки составило около 17 дней.. Изменения содержания аммиачного азота в воде резервуаров биофильтров, соответствующих биочипу и шарику кипящего слоя, были в основном одинаковыми, демонстрируя колеблющиеся изменения. Пик аммиачного азота появился через 21 день при концентрациях 7,88 мг/л и 7,57 мг/л соответственно, что указывает на то, чтоВремя образования биопленки для биочипа и шарикового биофильтра с псевдоожиженным слоем составило около 21 дня.. Содержание аммиачного азотав баках биофильтров, соответствующихэти два носителя упали до самого низкого уровня - 43 дня и 45 дней соответственно..
2.2 Изменения значения pH воды в разных культуральных резервуарах
ОтРисунок 3, видно, что исходное значение pH культуральной воды составляло 7,3. По мере увеличения времени культивирования значение pH воды в каждом культуральном резервуаре имело тенденцию к снижению. Через 12 дней значение pH во всех культуральных резервуарах было менее 6,0, что неблагоприятно для роста культивируемых видов.Поэтому после 12 дней образования биопленки следует уделить внимание корректировке значения pH воды в культуральном резервуаре..
2.3 Анализ состава микробного сообщества на биопленках различных биофильтрующих сред и в воде
2.3.1 Состав микробного сообщества на уровне типа
Как показано вРисунок 4,на уровне типа доминирующие бактерии на биопленках трех биофильтрующих сред были одинаковыми: все они представляли собой Proteobacteria, Actinobacteriota, Bacteroidota и Chloroflexi. Их совокупная относительная численность составила 68,96%, 64,74% и 65,45% соответственно. Доминирующие бактерии в соответствующей культуральной воде были разными. Доминирующими бактериями в W1 были Actinobacteriota с относительной численностью 64,66%. Доминирующими бактериями в W2 и W3 были протеобактерии с относительной численностью 34,93% и 50,10% соответственно.
Рис. 4 Состав сообщества бактерий в разных биопленках и воде на уровне типа
2.3.2 Состав микробного сообщества на уровне семьи
Как показано вРисунок 5На биопленках трех сред около 48% бактерий представляли собой бактериальные сообщества с относительной численностью менее 3%. Доминирующие бактерии B1 и B2 были одинаковыми, обе принадлежали Xanthomonadaceae, с относительной численностью 11,64% и 9,16% соответственно; доминирующей бактерией B3 была JG30-KF-CM45 с относительной численностью 10,54%. Доминирующие бактерии в культуральной воде отличались от бактерий на биофильтрационной среде. Microbacteriaceae были абсолютными доминирующими бактериями в W1 с относительной численностью 62,10%; доминирующие бактерии W2, помимо Microbacteriaceae (13,82%), включали также определенную долю Rhizobiales (8,57%); доминирующими бактериями в W3 были Rhizobiales с относительной численностью 38,94%, за ними следовали Flavobacteriaceae с относительной численностью 15,89%.
Подсчитано 50 лучших видов на уровне рода.. После обработки числовых значений изменения численности различных видов в пробах отображались посредством цветового градиента цветных блоков. Результаты показаны наРисунок 6. Leifsonia была доминирующей бактерией в W1 с относительной численностью 56,16%; доминирующими бактериями в W2 были Leifsonia (10,30%) и Rhizobiales_Incertae_Sedis (8,47%); доминирующей бактерией в W3 были Rhizobiales_Incertae_Sedis с относительной численностью 38,92%. Среди идентифицируемых бактерий на биопленках Thermomonas был доминирующим родом в B1 с относительной численностью 4,71%; доминантными родами в B2 и B3 были Nitrospira с относительной численностью 4,41% и 2,70% соответственно.
Рис. 5 Состав сообщества бактерий в разных биопленкахи вода на уровне семьи
Рис. 6 Тепловая карта состава бактериального сообщества в различных биопленках и воде на уровне рода
2.4 -Анализ разнообразия микробных сообществ на биопленках различных биофильтрующих сред и в воде
Как показано вТаблица 1, индекс Шеннона микробных сообществ на биопленках различных сред был больше, чем у соответствующей культуральной воды, а индекс Симпсона был противоположным. При анализе соответствующей культуральной воды индекс Шеннона бактериального сообщества W2 был самым высоким, значительно выше, чем у W1 и W3, тогда как индекс Симпсона был значительно ниже, чем у W1 и W3, что указывает на то, что его -разнообразие было самым высоким. В отличие от -разнообразия культуральной воды, хотя индекс Шеннона бактериального микробного сообщества в среде B2 был самым большим, а индекс Симпсона был самым маленьким, между тремя средами биофильтра не было существенной разницы. Охват секвенированием всех образцов был выше 0,990, что указывает на то, что глубина секвенирования может отражать истинный уровень образцов.
2.5 Влияние различных биофильтрующих материалов на рост большеротого окуня
Таблица 2показывает ситуацию с ростом большеротого окуня в различных группах биофильтров. После 44 дней культивирования конечная масса тела и скорость прироста веса большеротого окуня в группе, выращиваемой с использованием квадратных губок, были значительно выше, чем в группах, получавших шар с псевдоожиженным слоем и биочип, а коэффициент конверсии корма был значительно ниже, чем в других группах. Выживаемость большеротого окуня в каждой группе составила более 97%, без существенных различий между группами.
3. Заключение и обсуждение.
3.1 Время формирования биопленки различных биофильтрующих материалов
Биопленки прикрепляются к поверхности биофильтрационного материала. Материал, структура и удельная поверхность биофильтрующего материала являются основными факторами, влияющими на образование биопленок. Существует два распространенных метода культивирования биопленок: метод формирования естественной биопленки и метод формирования инокулированной биопленки. Различные методы формирования биопленки влияют на время созревания биопленки. Ху Сяобин и др. использовали четыре различных метода формирования биопленки, и результаты показали, что при использовании таких методов, как добавление хитозана, ионов железа и инокуляция сбрасываемым илом для образования биопленки, время созревания биопленки было короче, чем у метода формирования естественной биопленки. Хотя добавление полезных микроорганизмов или активных веществ может сократить время образования биопленки, существуют такие проблемы, как сложность получения инокулята, сложная конструкция процесса и высокая стоимость. Гуан Минь и др. в условиях низкого содержания органических веществ напрямую использовали сырую воду для образования биопленки, и бак биофильтра успешно запустился в результате естественного образования биопленки примерно через 38 дней. Этот результат исследования аналогичен результатам настоящего исследования. Результаты этого исследования показывают, что при тех же условиях образования биопленки время образования биопленки квадратной губки было короче, чем у двух других биофильтрующих материалов. Это может быть связано с большой удельной поверхностью, сильной гидрофильностью и легкостью прикрепления биопленки к квадратной губке. Удельная поверхность квадратной губки достигает 32 000–35 000 м²/м³, что намного больше, чем у двух других материалов. Кроме того, материал квадратной губки — полиуретан, который расширяется под воздействием воды, обладает высокой гидрофильностью и способствует прикреплению и росту микроорганизмов в воде. Результаты исследования Ли Юна и соавт. также показало, что пусковые-характеристики и эффективность удаления аммиачного азота у полиуретановой губки были лучше, чем у полипропилена, что согласуется с результатами этого исследования. Кроме того, в этом исследовании удельная поверхность биофильтрационного материала Biochip достигала 5500 м²/м³, что намного больше, чем у биофильтрационного материала с шариками с псевдоожиженным слоем, но время образования биопленки было в основном таким же, как и у шаров с псевдоожиженным слоем. Это может быть связано с размером пор. Некоторые исследования показали, что внутренний пространственный масштаб биофильтрующей среды влияет на рост биопленок. Хотя некоторые биофильтрационные материалы имеют большую удельную поверхность, их поры мелкие, а размер пор намного меньше толщины зрелой биопленки, что может легко привести к закупорке пор, затрудняя максимальное накопление биопленки в порах. Поры биочипа малы, что приводит к замедлению роста биопленки и увеличению времени ее образования.
3.2 Состав микробного сообщества биофильтрационной среды и культуральной воды
В данном исследовании доминантные бактерии на биофильтрационной среде и в соответствующей культуральной воде были разными. Индекс Шеннона биопленок на биофильтрационной среде был выше, чем у соответствующей культуральной воды, что указывает на то, что биофильтрационная среда оказывает эффект обогащения микроорганизмов. Это согласуется с результатами исследования Hu Gaoyu et al. Существует множество факторов, влияющих на структуру микробного сообщества, таких как тип носителя, глубина фильтра, соленость, концентрация органического вещества и т. д. Один и тот же биофильтрационный материал в разных условиях культивирования будет иметь разные микробные сообщества на биопленке. Однажды автор изучал ситуацию с образованием биопленки в шаровых биофильтрах с псевдоожиженным слоем в системе рециркуляционной аквакультуры гигантских пресноводных креветок (Macrobrachium rosenbergii). Результаты показали, что доминирующим типом биопленки были Firmicutes, тогда как в этом исследовании доминирующим типом биопленки шара с псевдоожиженным слоем были Proteobacteria. Основной причиной этой разницы могут быть различные условия аквакультуры. Три биофильтрующих среды, использованные в этом исследовании, имели одинаковые начальные условия для культивирования биопленок. Возможно, что из-за разных физических характеристик сред толщина образующихся биопленок и внутренняя среда также были разными, что приводило к различиям в микробных сообществах. Следовательно, разница в носителях является основной причиной различий микробных сообществ. Кроме того, в процессе аквакультуры водная среда и микробное сообщество влияют друг на друга. Причины различий микробных сообществ могут быть связаны с факторами окружающей среды. Например, исследования Юань Цуйлиня показали, что общее количество гетеротрофных бактерий в организме; Фань Тинъюй и др. считали, что значение pH может существенно влиять на общее содержание азота в воде и играет ключевую роль в распространении водных бактериальных сообществ во внутренних участках рек. Аммиачный азот, общий фосфор и хлорофилл а также в разной степени влияют на состав бактериальных сообществ водоема. Факторы окружающей среды, вызывающие различия в составе микробного сообщества в этом исследовании, все еще нуждаются в дальнейшем подтверждении.
3.3 Влияние различных биофильтрующих материалов на рост большеротого окуня
Судя по результатам роста, большеротый окунь в группе с квадратной губкой рос быстрее всех, при этом скорость прироста веса была значительно выше, чем у двух других сред, и самый низкий коэффициент конверсии корма. Это согласуется с результатами предыдущих исследований. В этом исследовании образование биопленок и аквакультура проводились одновременно. Судя по времени формирования биопленки, биопленка квадратной губки созревала раньше, а после созревания биопленки концентрации аммиачного и нитритного азота в воде всегда были ниже, чем в двух других средах. Кроме того, квадратная губка обладает определенной фильтрационной способностью, содержание твердых взвешенных веществ в культуральной воде было ниже, а вода была относительно прозрачной. Лучший рост большеротого окуня в группе квадратных губок может быть связан с хорошим качеством воды. Однако влияние очистки квадратных губчатых сред на общий азот, общий фосфор и перманганатный индекс в воде требует дальнейшего изучения. Стоит отметить, что в ходе эксперимента значение pH имело общую тенденцию к снижению. После 12 дней культивирования значение pH во всех культуральных резервуарах было менее 6,0, что согласуется с результатами исследования Zhang Long et al. Снижение значения pH связано с тем, что в процессе культивирования биопленки образуется большое количество ионов водорода, что приводит к снижению значения pH воды. Следовательно, в процессе формирования биопленки необходимо оперативно регулировать значение pH воды в культуральном резервуаре, чтобы обеспечить его соответствие нормальному диапазону роста культивируемых видов. Учитывая экономические затраты, рыночная цена квадратной губки составляет 70–100 юаней/кг, а ее стоимость находится между двумя другими биофильтрующими материалами. В сочетании с результатами роста в краткосрочной перспективе квадратная губка представляет собой относительно практичный биофильтр для очистки воды в циркуляционной аквакультуре. Однако квадратная губка имеет низкую прочность и короткий срок службы. Его долгосрочные-эффекты от использования и последствия для аквакультуры требуют дальнейшей проверки.
В итоге,В естественных условиях образования биопленки биофильтрующий материал из квадратной губки имеет самое короткое время образования биопленки, умеренную цену, а конечная масса тела и скорость прироста веса большеротого окуня в группе из квадратной губки были значительно выше, чем у двух других биофильтрующих материалов. В краткосрочной перспективе это относительно практичный биофильтр для очистки воды для оборотной аквакультуры.